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兩步發(fā)酵法的第一步，先用根霉將糖類發(fā)酵生成富馬酸，即富馬酸發(fā)酵，這里的糖較多的使用葡萄糖，葡萄糖可由淀粉經(jīng)雙酶水解而得。

第二步是在前面所產(chǎn)的富馬酸中接入酵母菌或細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵，將富馬酸轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-蘋(píng)果酸，即轉(zhuǎn)化發(fā)酵。采用這種方法，蘋(píng)果酸對(duì)糖轉(zhuǎn)化率最高可達(dá)60%以上，但是畢竟發(fā)酵周期太長(zhǎng)，前后加起來(lái)要8～9天。雖然兩步法與一步法一樣，國(guó)內(nèi)外學(xué)者正在不斷地探索，取得了一些有價(jià)值的進(jìn)展，但至今仍然未見(jiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的報(bào)道。 無(wú)論是一步法還是兩步法發(fā)酵，如以淀粉為原料，在使用前都需進(jìn)行水解處理，使之成為葡萄糖，而淀粉的水解方法是雙酶水解法。

3.將反丁烯二酸或順丁烯二酸經(jīng)高溫高壓催化加水，可制得DL-蘋(píng)果酸。4.萃取法將未成熟的蘋(píng)果、葡萄、桃等的果汁煮沸，加入石灰水，生成鈣鹽沉淀，然后再經(jīng)處理生成游離蘋(píng)果酸。此法目前已不采用。5.發(fā)酵法從反丁烯二酸利用生物酶發(fā)酵生產(chǎn)左旋蘋(píng)果酸。6.DL-蘋(píng)果酸的合成以順丁烯二酸或反丁烯二酸在高溫、加壓下水合制取。用陰、陽(yáng)離子交換樹(shù)脂提純。7.L-蘋(píng)果酸的合成利用短桿菌氨基因細(xì)胞由反丁烯二酸制取。8.：FC，22，38，50，54；BU，39。9.制法：于高壓反應(yīng)釜中加入順丁烯二酸（2）1.16kg（10mol），水2.1L，攪拌下升溫至180～190℃，保持壓力1Mpa，反應(yīng)10h。冷卻至100℃以下，放出殘壓。將反應(yīng)液倒入蒸餾瓶中，減壓濃縮，直至有結(jié)晶析出。冷卻，抽濾，干燥，得蘋(píng)果酸（1）1.2kg，mp128～130℃。收率90%。